Mudanças estruturais por vírus da febre amarela (YFV) induzidas por alta pressão hidrostática: obtenção de partículas inativadas
Mendes, Ygara da Silva
A febre amarela é uma doença aguda causada por um flavivírus transmitido por mosquitos, principalmente em áreas tropicais como na América do Sul e na África sub-Saariana. Os humanos e os primatas são os principais animais infectados pelo vetor. O Vírus da Febre Amarela (YFV) é membro da família Flaviviridae, que compreende vírus envelopados de 40-60 nm de diâmetro com um capsídeo icosaédrico que contém uma fita simples de ARN como genoma. Seu ARN codifica três proteínas estruturais, a proteína capsídica C, uma pequena proteína de membrana M e uma grande proteína de envelope E, além de sete proteínas não estruturais. Acredita-se que a entrada do YFV na célula ocorra por endocitose mediada por receptor e uma subseqüente fusão do vírus induzida pelo baixo pH, através do ectodomínio da proteína E, com a membrana endossomal. Neste trabalho, nós buscamos a inativação por pressão do YFV e estudamos sua estabilidade e a dinâmica das partículas sob alta pressão hidrostática a fim de verificar as alterações estruturais promovidas por este processo. Com este objetivo, nós inicialmente verificamos a condição ideal de pressão e tempo que levaria à completa inativação das partículas virais, já que a alta pressão tem sido utilizada para inativar diversos vírus. Para entender como estas partículas são inativadas, nós primeiramente promovemos perturbações na estrutura utilizando agentes desnaturantes químicos, como a uréia, e agentes físicos, como a alta temperatura. O processo de perturbação do YFV foi monitorado principalmente por medidas de espectroscopia de fluorescência, e os resultados mostraram que quando o vírus é submetido a pressões acima de 3.0 kbar, ocorria alterações significativas no centro de massa do espectro do triptofano, condizente com os ensaios de infecciosidade, e este se mostrou ser um processo reversível. Ao contrário, os valores de espalhamento de luz se mantiveram constantes ao longo do tempo de inativação. Esta reversibilidade foi confirmada por gel filtração em HPLC, onde as partículas pressurizadas e inativadas se mantiveram tão íntegras como as partículas nativas. Estes resultados sugerem que a estrutura viral provavelmente adquiriu uma conformação diferente da nativa, mas ainda manteve sua integridade. Experimentos de ligação de sondas fluorescentes como bis-ANS e LAURDAN nos confirmam a reversibilidade deste processo, indicando que a alteração conformacional provavelmente estaria ocorrendo a nível de glicoproteína E, responsável pela interação vírus-célula, e não por alteração na estrutura do envelope lipídico. Estes resultados podem abrir novos caminhos para o desenvolvimento de vacinas contra diversos flavivírus que vêm causando surtos epidêmicos em todo mundo.